책임운영기관 농촌진흥청 국립축산과학원 (로고)

초록:  Ⅳ. 연구개발결과 <축산물의 기능성 펩타이드 정량 및 동정기술 개발> 본 연구는 축산물의 소비촉진을 위하여 축산물 유래 기능성 펩타이드의 정량 및 동정기술을 개발함으로써 축산물의 부가가치 향상과 기능성 식품소재로서의 축산물 이용성증진을 목적으로 수행하였으며 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 축산물 내 기능성펩타이드 분리 및 정량기술 확립 기능성 펩타이드의 분리 및 동정기술 개발을 위해 닭고기 가슴살의 펩타이드 분리기법(가열처리 및 한외여과 분리방법)에 따른 저분자추출물 수율 분석결과(표 1-1), 분쇄 및 가열처리 한 후 바로 <3kDa으로 분리한 추출물의 수율이 2.14±0.05%로 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한 분리된 기능성 펩타이드의 정량분석을 위해 MALDI-TOF 분석법을 확립하였는 바 닭고기 가슴살 분쇄물을 크기배제크로마톡래피로 분리한 후 분자량을 분석한 결과, 1,361Da을 주로 하는 분자량 스펙트럼을 획득하였다. 2. 저분자 펩타이드의 항산화 활성 분석법 확립 다음은 돈육을 기능성 펩타이드 분리 및 정량기술 개발을 위해 돈육을 비가열 및 가열 돈육에 인체내 소화효소(펩신, 트립신, 키모트립신을 단독 또는 복합)이용하여 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24시간 동안 가수분해 한 후 ABTS법으로 항산화능 확인한 결과 펩신 처리군의 경우 12시간 가수분해한 시료가 43.4%로 가장 높은 항산화활성을 나타냈다. 또한 펩신과 판크아틴 0.5%+0.5%처리구를 각각 2시간 및 4시간 가수분해 하였을 때 가장 높은 단백질농도를 나타냈음을 확인하였다. 저분자 생리활성 펩타이드의 기능성 탐색을 위해 ABTS벅과 FRAP법을 실시한 결과 BTS법의 경우 3kD 이하 펩타이드가 88.0%로 가장 높은 활성을 나타냈으며, FRAP법의 경우 3kD 이하 펩타이드가 29.5%로 가장 높은 활성을 나타내었다. 3. 기능성 펩타이드의 동정기술 확립 축산물유래 기능성 펩타이드의 분석법을 확립하기 위하여 LC-ESI-MS/MS의 최적조건을 설정하고, 2차 년도 설정된 저분자 펩타이드 분리방법 및 HPLC 분석조건에 따라 분리한 돼지 안심과 닭가슴살 유래 펩타이드 분획을 이용하여 LC-EIS-MS/MS 분석 확립하고 동정한 결과 SEKATGV와 QAQSTR 등 41종의 저분자 펩타이드가 동정되었다. 돼지뒷다리살과 발효생햄의 항산화활성을 평가한 결과 시료 분쇄물과 가열처리군의 항산화 활성은 큰 차이를 보이지 않았으나, 효소+가열처리 시 항산화활성은 ABTS법과 DPPH법 모두 증가하였는데, 이는 효소에 의한 단백질 가수분해로 인하여 저분자 펩타이드가 생성되었기 때문이라 생각된다. <효소처리에 의한 기능성 펩타이드 생산 및 활용기술개발> 본 연구과제는 축산물내 산화억제 및 아세틸콜린에스테레이스 억제 펩타이드 탐색을 위해 젤라티분해물과 수입산 및 국내산의 축산물을 비교하여 실시하였다. 1. 아세틸콜린에스터레이스 억제활성 평가 아세틸콜린의 증가는 기억력과 인식력을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 뇌 속의 아세틸콜린은 시냅스 간극(synaptic cleft)에 있는 아세틸콜린 분해효소 (acetylcholinesterase)에 의해서 조절된다. 이 아세틸콜린 분해효소 (acetylcholinesterase)의 작용을 억제하면 아세틸콜린 (acetylcholine)의 분해를 막아 사용 가능한 아세틸콜린 (acetylcholine)의 양을 최대한 늘릴 수 있고 콜린성 신경전달 (cholinergic neurotransmission)이 증가되어 기억력 등 인지능력을 개선시킨고 알려져 있다. 미생물 유래 효소인 Alcalase, Protamex, Flavorzyme을 이용하여 분해된 분해산물 그리고 이 분해산물을 50 kDa <, 50 kDa < < 3 kDa, < 3 kDa로 분획하여 시료로 사용하였다[Table 16]. 이들 시료가 아세틸콜린 분해를 억제하여 콜린성 신경계 증진 효과를 나타내어 결과적으로 감퇴된 학습 및 기억력 개선 효과가 있는지 확인하고자 하였다. 2. 국내산 및 수입산 축산물의 기능성 펩타이드 특성분석 위장관 효소를 이용하여 분유에 대한 OPA를 이용하여 가수분해물의 펩타이드 함량 측정한 결과 수입산이든 국내산이든 펩타이드 함량은 pepsin 처리 2시간 후 2.7mg의 tryptone에 해당하는 펩타이드를 생성하였으며, 그 후 pancreatin 처리해도 그 양은 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다. 각 분유에 대한 ABTS free radical 소거능 활성을 조사한 결과[Table 20] Control은 가수분해물 대신 증류수로 측정한 것이며 pepsin처리한 후 2시간에서 모든 분유는 45 %의 활성을 나타내었다. pancreatin의 연속적 처리 후에 즉 pepsin 2시간 + pancreatin 2시간 처리 후에 이미 70%이상 활성을 보였으며 그 활성은 10시간의 반응후에도 약간의 차이는있으나 비슷한 활성을 보였으며 국내 B사의 경우에서 다른 분유보다 4-5% 높은 활성을 나타내었다. 3. 합성 펩타이드의 in vitro 산화제어 기능성 펩타이드 규명 합성펩타이드을 이용하여 산화제어 기능성을 분석한 결과 7번 펩타이드인 LAYFYPELFRQ가 항산화능이 가장 높게 나왔고, 4번 AYFYPELFRQF, 5번 TKVIPYVRYL, 1번 KVIPYVRYL, 9번 KVKEAMAPK 2번 GVSKVKEAMAPK 순으로 항산화 활성이 있는 것으로 확인 되었다. 3번과 6번, 8번은 ORAC assay에서는 항산화능을 갖고 있지 않는 것으로 확인 되었다. <발효에 의한 기능성 펩타이드 생산 및 활용기술 개발> 발효기술을 이용하여 기능성 펩타이드 생산 및 활용기술 개발을 목적으로 실시한 시험에서 개체유(10 시료)의 펩타이드 분석결과 4 kDa 이하에서 142-350개의 펩타이드가 검출되었으며 모든 개체의 공통 펩타이드는 10개가 관찰되었다. 1. 신생아 분변에서 분리한 비피도박테리움 롱검을 이용한 케이신 배양액의 항산화능탐색 발효 시간 별 발효유 분획물의 항산화 활성을 조사한 결과 ABTS radical 소거능과 총 페놀 함량 모두 배양시간이 지남에 따라 증가하다 48시간에서 감소하는 경향을 보였다. 즉, 24h 배양시 가장 높은 활성을 갖고 있는 것으로 확인된다. ABTS radical 소거능 측정 실험 결과 3KDa 이하 저분자 펩타이드 분획물에서 80.3% 로 높은 항산화능을 가진 것으로 확인되었다. 신생아에서 분리한 B. longum으로 분해시킨 케이신의 펩타이드를 동정하였다. B. longum으로 케이신을 24시간 분해시 2107, 1994, 1881 Da의 펩타이드가 주로 생산되었으며 이들은 모두 항고혈압 활성이 있는 것으로 보고된 바 있다. 2. L. salivarius와 E. feacalis의 최적 발효 조건 정립 발효기술을 이용한 최적 펩타이드 생산조건을 알아보기 위해 표면반응분석 결과 L. salivarius 최적조건은 x1(온도)는 40℃, x2(pH)는 pH 6.3 그리고 x3(배양시간)은 35.3시간으로 나타났으며, 표면반응분석 결과 E. feacalis 최적조건은 x1(온도)는 38.8℃, x2(pH)는 pH 7.5 그리고 x3(배양시간)은 36시간으로 확인되었다. 3. 항산화 효과를 갖는 잠재적 기능탐색 VLPVPQ 펩타이드는 이미 항산화 펩타이드로 문헌에 보고된 것으로 본연구에서는 이 펩타이드를 포함한 두 개의 잠재적 항산화 활성을 갖는 펩타이드를 동정하였는데 VLSLSQSKVLPVPQ K와 VLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQA이었다. 또한 αS1-CN과 β-CN에서 항고혈압 펩타이드를 생성하였다. LC-ESI MS/MS 분석 시 β-CN에서 9개의 잠재적 항고혈압활성을 갖는 펩타이드를 생성하였다. YQEPVLGPVRGPFPIIV, GEPVL GPVRGPFPIIV, GPVRGPFPII, GPVRGPFPIIV, YQEPVLGPVR, LNVPGEIVE를 포함하고 있으며, αS1-CN의 경우도 TTMPLW포함하여 9개의 항고혈압활성을 갖는 펩타이드를 생성하였다. 4. 기능성 숙성치즈 제조 기술 확립 축산원 개발 내산소성이 있는 비피도박테리움 롱검균주를 고다치즈와 체다치즈의 숙성치즈에 스타터 유산균으로 활용하여 숙성과정별 특성을 조사한 결과 숙성기간에 따른 처리구별 단백질 분해능을 조사한 결과 숙성기간이 증가함에 따라 단백질분해능이 증가하는 것으로 나타나 정상적으로 숙성이 진행되는 것으로 나타났다. 숙성기간과 처리구에 따른 총페놀함량을 조사한 결과 대조구보다 롱검균주가 들어간 처리구 T2에서 숙성이 진행될수록 더 높은 항산화능을 보였다. <기능성 펩타이드에 의한 면역반응 조절기작에 관한 연구(국제공동)> 축산원에서 개발한 E. faecalis 와 B. longum의 효과를 알아보기 위하여 일본 오사카대학과 국제공동연구과제로 수행한 유산균 발효물의 면역반응 효과를 시험한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. B. longum 섭취는 음식물 알레르기의 증상을 감소효과 50 mg의 OVA로 challenge할 때는 5번째 challenge이후 양성 대조군 마우스의 87.5%가 설사 증세를 보였으나, 유산균 처리 그룹의 경우 더 적은 설사 증세를 보였다. 또한 E. faecalis 처리 그룹 (75%) 보다는 B. longum 처리 그룹 (44.4%) 에서 더욱 급격한 음식물 알레르기 예방 효과가 관찰되었다B. longum 처리 그룹 (44.4%) 에서 더욱 급격한 음식물 알레르기 예방효과가 관찰되었다. 2. T helper type 2 (Th2) 세포와 Foxp3+ regulatory T (Tregs) 세포는 설사 증세의 감소와 관련성 확인 B. longum이 설사 증세를 줄여줌에도 불구하고, 항원 유도 음식물 알레르기 모델 그룹들 전체에서 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5는 대량 유도되었으나 Th1 사이토카인인 IFN-g, Th17 사이토카인인 IL-17은 관찰되지 않았다. Foxp3+ Treg 세포에 의해 음식물 알레르기가 감소할 가능성 역시 확인하였다. (29, 30) B.longum 처리 그룹을 확인하였을 때 비장, 장간막림프절, 소장 점막고유층 모두에서 Foxp3+ Treg 세포는 변화가 없었다. 이를 통해 B.longum에 의한 음식물 알레르기 증상 완화가 Th2 면역 반응이나 Foxp3+ Treg 세포에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.