책임운영기관 농촌진흥청 국립축산과학원 (로고)

소 생체내 난자 채취법을 이용한 수정란 생산

 Ⅰ. 기술의 소개

 수정란 이식 기술은 가축의 유전적 개량을 목적으로 전세계적으로 널리 이용되고 있다. 이러한 수정란 이식 기술의 개량효과를 극대화 하기 위하여는 유전적으로 우수한 공란우를 이용, 성선자극호르몬(FSH 등)투여에 의한 다배란을 유도, 다수의 수정란을 생산하고 이를 이용한 고능력 자축의 생산성을 높여야 하는 것이 가장 큰 목적이다. 그러나, 이러한 전통적인 수정란 이식 기술은 다배란처리에 따른 개체간의 반응에 있어서 변이가 심하다는 가장 큰 문제점을 가지고 있으며, 이 문제점을 해결하기 위하여 많은 연구가 수행되어 왔으나 그 발전은 극히 미미한 실정으로 아직까지도 산업화의 큰 걸림돌이 되고 있다. 이러한 기술을 극복하고자 근래에는 난자의 성숙, 수정 및 발생에 관한 연구가 산업, 학문적으로 활발히 진행되어 왔다. 이러한 결과 1987년부터는 체외 성숙·수정 및 배양에 의하여 생산된 수정란에 의하여 송아지 생산을 처음 보고하였으며, 또한 1990년부터는 체외에서 생산된 수정란을 동결-융해 후 이식을 실시하여 송아지 생산을 최초로 보고하였다. 그러나 이러한 기술은 수정란의 대량 생산에는 문제점이 없으나 사용되는 난소가 도축되는 암소에서 유래된 것이므로 이들 암소들의 유전능력을 파악할 수 없어 이 체외수정란을 이용하여 생산된 자축에서는 높은 능력개량을 기대하기는 어렵다. 따라서 최근에는 초음파진단기계의 발달과 더불어 다배란 처리와 난자의 유전능력을 알 수 없는 도축난소를 이용한 체외수정란의 단점을 보완하는 기술로 고능력우로 부터 생체 내 미성숙 난자를 채취하고 이를 체외수정에 공시하는 기술로 다배란 처리시와 같은 고능력 수정란을 생산을 하게 되었다. 이 방법은 공란우에 대해 손상이 적고, 높은 반복력이 있어서 널리 연구되고 있다. 이러한 초음파 유도 생체 내 미성숙 난포란 채취기술(Ovum pick-up, OPU)은 소의 다배란 수정란이식 기술을 보완할 수 있는 기술로써 많은 연구가 이루어지고 있어 초음파기기를 이용한 수정란 생산기술의 발전 가능성을 시사하고 있다.

 Ⅱ. 기술의 내용

1. 소의 발정주기 중 난소의 변화

그림 30. 소의 난소내 원시난포(1), 성숙난포(5), 황체(3), 백체(7) 발생 모식도

  소는 발정주기중에 성선자극호르몬의 영향을 받아 난소 내 난포가 성장하여 발정증상을 보이며 이 그라피안(성숙) 난포(화살표)가 배란하여 배란점 난포의 협막과 과립막세포가 황체화하여 황체형성 기능을 발휘하는 등 난소는 발정주기중에는 크게 난포기와 황체기(임신유지호르몬 분비장소)로 구분된다(위의 사진의 붉은 점이 황체를 나타냄). 소에 있어서 이처럼 발정주 기중의 난소크기 변화를 보인다. 한우난소의 평균 장경은 3.0~3.9cm 였으며 평균 단경은 2.0~2.9cm 였으며 난소의 장·단경 및 두께에 있어서 좌측보다는 우측난소가 길게 나타난다.

2. 초음파 유도 채란 기술의 개요

  생체로부터 난자를 회수하기 위하여 최근에는 초음파 진단기의 발달에 따라 사람의 불임 시술에 이용되는 방법을 소에 적용한 이후 여러 연구자들에 의하여 난자채취방법이 개선되고 이용되고 있다.

3. 초음파의 원리

  초음파란 인간의 가청범위(20~20,000 Hz 정도)를 넘어선 소리의 범위를 말하는데 소리의 반사, 확산 및 흡수작용을 이용하여 생체내의 조직이나 기관에 대해서 비파괴적인 검사로서 반복검사에도 장애가 없으며 실시간으로 영상을 표시할 수 있기 때문에 정확한 움직임을 진단 할 수 있고 판단할 수 있는 원리를 가지고 이 기기는 3가지로 구성된다.

  소에 주로 사용되는 탐촉자의 주파수는 주로 5~7.5 ㎒의 범위를 사용하며 형태는 영상이 사다리꼴로 나타나서 좁은 부위를 통하여 비교적 넓은 부위를 볼 수 있는 Convex probe(반 부채형태)를 이용한다. 또한 영상은 액체로 충만된 곳은 반사파가 없어지므로 검게 표시되므로 난포 등의 채란시 유용하다.

4. 초음파유도 난포란의 회수율에 미치는 요인

  발정주기에 따른 난자회수율을 살펴보면 3개월에 걸쳐 발정주기 3~4일, 9~10일 그리고 15~16일에 난자를 회수하여 발정주기에 따른 난자회수율은 현재 기술의 수준은 50%내외로서 발정주기에 따른 차이는 보이지 않았으나 난포의 수는 발정주기 3~4일에 가장 많았으며 발정 주기당 회수 난포의 평균수는 10.3±7.1개 정도이며, 난포란 채취빈도가 난자회수율에 미치는 효과에 있어서 1주에 1회 또는 2회 난자채취를 하는 경우 주당 회수 난자수는 2회가 많았으나 시술 회당 난포수와 난자수는 차이가 없었다. 바늘의 굵기에 있어서는 채취용 바늘이 너무 굵은 경우는 작은 난포에 손상을 주고 혈액이 많이 유입되고 난포액 흡입시 난포액의 유실도 일어나며, 이와 반대로 채란 바늘이 가는 경우에 난포액을 정확히 흡입은 가능하나 흡입시 난자에 부착된 난구세포의 탈락으로 손상을 입히는 경우가 있으므로 주로 17, 18, 19gauge를 이용 난자를 회수한다. 난포란의 채란시 적용하는 채란음압은 일반적으로 40~120 mmHg를 이용하고 있다.

5. 수정란 생산과 이식

 체외수정 기술에 의한 송아지 생산의 보고는 최초로 체내성숙 난자의 체외수정기술에 의한 송아지를 1982년에 보고한 이래 많은 연구가 진행되어 본 연구실에서도 자축생산의 기술이 갖추어져 있다. 그러나 우수한 공란우로부터 생체내에서 우수난자를 확보하여 이를 이용하여 송아지를 생산한 보고는 최초로 Loony 등이 1994년 부터이다. 본 연구실에서도 우수한 한우의 생체로부터 난포란을 회수하여 송아지를 생산할 수 있는 기술을 보유, 연구중이다.

 Ⅲ. 재료 및 방법

1. 채란용 공시우

  소에 있어서 OPU 시술은 번식기관 특히 난소가 정상이고 발정이 주기적으로 반복되는 한우를 선발하여 채란에 공시하면 된다. 체내난소의 채란직전의 난포는 2~7㎜크기를 채란하면 된다.

2. 초음파 난포란 채취기구

 OPU에 이용된 초음파진단기는 가축용 6.5 ㎒ (convex type) 탐촉자가 부착된 휴대용 SA 600 (Medison Co., Korea)기기를 이용하면 된다(그림 3, 4 참조). 난포액의 흡입은 음압조절이 가능 한 음압펌프를 이용(그림5 모니터 앞 기기 참조)하였으며 채취용 바늘은 57cm길이(그림 4)의 17Gauge의 바늘 끝에 초음파 반향부가 있고 50ml원심분리관(그림 4 참조)과 연결시켜서 사용하면 된다.

3. 생체로부터 초음파기기를 이용한 채란방법

  공란우를 보정틀에 보정시킨 후 진정을 유도하기 위해 0.4㎖ 의 Rumpun을 근육주사하고, 부가적으로 5㎖의 lidocaine HCl (광명,한국)을 이용 미근부의 경막외 마취를 하였다. 또한 자궁경부 주변에 마취를 유도하여 주사바늘 통과 시 고통을 줄이기 위해 lidocaine HCl 을 2ml을 도포하여 마취를 실시하였다.

  마취가 완료된 공란우는 외음부 주위를 깨끗이 세척한 후, 탐촉자의 선단을 Sonogel을 도포(공기층이 없도록 도포)를 하여 초음파의 전달이 용이하게 한 다음 직장검사용 비닐장갑이나 탐촉자의 면을 보호할 수 있는 재료를 사용하여 씌운 다음 탐촉자를 질내로 삽입하여 자궁경부의 좌측이나 우측에 위치시킨 다음, 반대편 손으로 직장벽을 통해서 난소를 탐촉자의 앞에 위치시켜 난소 및 난포를 초음파기기의 화면상에 정확히 나타내었다.

  난소를 조작하여 난포가 초음파진단기의 바늘유도선에 위치하도록 하여 채취바늘을 자궁경부 옆의 근육을 통과하여 화면상의 난포(둥근 흑점)로 삽입함과 동시에 음압을 발생시켰다. 난자회수시 음압은 대개 40~120mmHg를 이용하였는 데 주로 60~0mmHg(1분에 25ml내외 물을 흡인 할 수 있는 양)음압을 이용한다.

  난자의 회수시 사용하는 액은 소태아 혈청(FCS)과 heparin sodium (녹십자, 한국)이 첨가된 D-PBS액을 25~30℃로 데워서 채란에 이용하고 채란바늘내에 난포란이 바늘 내벽에 붙지 않도록 채울 때나 바늘내부에 있는 흡입 난자를 씻을 때 D-PBS를 이용하였다.

4. 생체로부터 채란된 난포란의 체외성숙

  OPU가 끝나면 회수액을 되도록 이면 빠른 시간 내로 실내로 옮긴 후, 필터를 이용하여 Lacto-Ringers solution (대한약품,한국)에다 5%정도 FBS를 희석하고 여과액으로 사용하여 실체현미경 (Olympus, Japan) 하에서 음압에 의해 회수된 생체 내 미성숙난자를 찾아서 체외 성숙을 유도하였다.

  회수된 미성숙난자는 난구세포의 충실도에 따라 등급을 정하였다. 즉 1등급의 난자는 난자를 애워싸고 있는 난구세포가 4층 이상으로 충실하게 싸여 있는 것을, 2등급은 난구세포가 1-3층으로 둘러싸여 있는 것을, 3등급은 난구세포가 벗겨져서 나화된 경우, 4등급은 난구세포 가 팽창되어 있는 경우로 구분하였다.

  회수된 1~3 등급의 미성숙 난자는 배양액으로 3회 세척을 실시하고 10~100 ㎕ 소적에 옮겨서 체외성숙을 유도하였다. 체외성숙 유도는 5% CO2 와 95% 공기상태의 38.5℃의 배양 기(Forma Co. USA) 에서 20~22시간 동안 배양하여 체내로부터 채란 된 미성숙 난자의 체외성숙을 유도하였다.

5. 생체로부터 채란된 난포란의 체외수정

  소의 생체내로부터 채란 된 미성숙 난자의 체외성숙이 완료되면 체외수정을 실시하는데 종모우의 정액을 이용하든지 축협에서 공급하는 동결정액을 이용하면 되는데 동결정액을 이용하는 경우는 정액을 융해 후 정자농도가 5~6×106/ml 가 되도록 혈구계산판을 이용하여 정자의 농도를 조정하여 체외배양기내에서 수정을 6시간 공배양하여 체외수정을 유도하였다.

6. 수정란의 배양, 동결 및 이식

 체외수정 후 수정란의 배양은 체외성숙시와 동일한 신선 배양액으로 5회 세척을 실시한 다음 난구세포와 같이 10~100 ㎕ 소적내에서 배반포까지 공배양을 유도하였다. 수정란은 신선란으로 수란우에게 이식하는 것이 절대적으로 유리하지만 부득이한 사정으로 이식이 불가능하면 수정란의 장기 보존을 위해 동결을 하게 된다. 수란우가 부족하거나 수정란의 장거리 이동이 필요한 경우나, 장기 보관 또는 수출을 위하여 수정란의 발생력의 보존이 필요한 경우는 다음과 같이 액체질소에다 영구적으로 보관을 하는 것이 필요하다.

다음 그림은 이식직전의 수정란의 상태를 나타내는 것이다.

  수란우는 자연적으로 발정동기화된 개체 또는 CIDR 를 이용하여 인위적으로 동기화된 개체를 이용하여 신선 수정란 혹은 동결보존 수정란을 비외과적으로 수정란 이식을 실시하면 된다. 수란우의 임신감정은 수정란 이식 후 30~60일째 초음파 진단기와 직장 검사법에 의하여 임신을 확인하고 우수자축의 분만을 기대하면 된다.

 Ⅳ. 본 기술의 이용성

  이상의 방법으로 유전적으로 능력이 우수한 한우나 젖소를 이용하여 초음파기기를 이용하여 생체로부터 능력이 우수하고 명호가 확실한 미성숙 난자를 반복적으로 3~4일 마다 주기적으로 채취하고 이를 체외수정기술과 접목시킴으로서 고능력 소로부터 고능력 수정란을 반복적이고 연속적으로 수정란을 생산할 수 있는 기술을 구축하여 우수한 소의 개량속도를 앞당길 수 있고 기존의 많은 경비가 소요되는 다배란 처리기법 보다는 높은 효율의 수정란을 생산할 수 있어 네덜란드, 미국, 일본 등의 나라에서는 많이 연구되고 실용적으로 수정란이 생산되어 수정란 이식을 실시한다는 보고로 알 수 있으며, 본 기술의 이용으로 소의 능력을 조기에 개량을 촉진할 수 있는 기초기술로서 이용 가치가 높으며, 소의 개량기간을 단축함으로서 우수한 축군을 조성하고 유지가 가능한 기술이라고 사료되며 앞으로 본 기술이 더 많이 발전하기를 기대하는 바이다.